很漂亮的两篇文章，不论是站在筛选部、还是药化、计算部，亦或是生物部，都可圈可点，直接指向了 FIC 药物开发的几大核心问题[1-2]：
- 药物应该靶向蛋白质的哪个结构域？ 计算这个时候能发挥作用么？
- 采用什么方式发现苗头化合物？方法和策略不同，注定了 Novartis 和 Vividion 化合物效果的差异性。
- 发现了系列苗头化合物，选择哪个化学系列重点推进？怎么快速提高化合物的整体性能，尤其是像降低logP和提高渗透性这种似乎矛盾的地方，让其快速成为药！
一、WRN Helicase domian is the KEY!
WRN 有几个不同的结构域，如果是抑制其功能，抑制哪一部分才能在 MSI 中发挥作用？如果确定了核心发挥药理作用的结构域，采用什么方法发现 Hits？
对于第一个问题，将 WRN 突变，使其丧失部分功能，或者 knockdown/knockout 等，检测下活性，再复表达能完成验证。
通过 kd 和复表达，Novartis 确定了在 MSI 和 WRN 表现的合成致死仅和 Helicase 解螺旋功能有关。
二、采用什么药物筛选方式？
接下来就是第二个问题，怎么发现苗头化合物？
Follow 的项目有前人踏路还好，但是 FIC 项目，只能自己摸索。如果有计算部门，直接丢给计算人员，让计算人员去建模、虚拟筛选、计算结合能、分子动力学模拟·······然后测试活性，那计算部门算是头疼了。
虽然确定了核心是解螺旋结构域，但是是选择 ATP 的结合部位，还是核酸结合部位，抑或是别构部位？核酸结合部位太浅，ATP 结合部位有 walker motif，结合的驱动力是由于静电作用。在分析氨基酸的保守性，发现可能难以实现选择性。
那就定别构，但是定哪里的别构？把一个静态蛋白的各个口袋全部框选出来？每个口袋进行对接筛选？不是头呀！如果再碰到领导固执，坚持在现阶段就虚拟筛选，验证下花几十万招的计算人员能力，验证花大几十万买的药物设计软件，那就只能逼走计算人员出去开公司拉融资当老板……
看诺华的最终晶体解析数据，左侧的为 ATP 类似物和解螺旋结构域的结合构象，右侧是和抑制剂的结构构象，其中部分结构直接就反转了 180°，这个是计算不出来的……
终于开始进行表型筛选，检测 ATP 依赖性的 DNA 解螺旋和 DNA 依赖性的 ATP 酶活性，有试剂盒似乎并没有什么问题。然后，生物部开始进行筛选，结果发现命中率特别低。这个时候，领导怀疑生物人员的水平，详细询问操作的各个步骤细节，没发现问题，又说先检测下已有的 WRN 抑制剂，验证下试验人员检测准确性。结果发现，这个人检测的出来，那个人检测不出来的，重复后，两个人又反过来了。生物部开始抓狂，抠死各种细节，终于确定了能够维持稳定性的方法。
后面发现检测方法是稳定了，但是似乎公认的 WRN 抑制剂或许根本从头就是错的，比如化合物可能会诱导的蛋白聚集或者沉淀，亦或者化合物会和核酸作用等各种作用。。。
诺华直接出了一篇 ChemMedChem 来记录吐槽这段儿艰辛的探索之路 [3]。
后面整合团队，深入分析，终于确定了合适的筛选方法。左侧的是 Novartis 采用的筛选验证方式，右侧是 Vividion 采用的方式。
Novartis 部分：最开始采用通用的方式，WRN helicase assay，进行 ATP 酶活性分析，发现假阳性太高，命中也只发现共价化合物。进一步确定，发现是一个 ATP 竞争性的靶向 Cys727 的别构共价抑制剂。后面为了发现非共价抑制剂，采用的是 ATP-binding assay，(Cy5-ATPgamaS binding assay using TR-FRET)。
TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）是一种基于FRET（荧光共振能量转移）的生物化学检测技术，通常用于研究分子间的相互作用和距离变化。这种技术的核心在于两个荧光标记分子之间的能量转移，其机制如下：1. 荧光标记实验中需要两种荧光分子，一种是供体（donor），另一种是受体（acceptor）。在本实验中，铕标记的链霉亲和素作为供体，而Cy5标记的ATPγS作为受体。
Vividion 部分：左侧为ADP，右侧为共价结合的抑制剂，和原始 ATP/ADP 结合构象大概类似。
三、结构优化
千辛万苦走到了这一步，药化和合成开始发力，设计合成各种化合物，提高活性，提高类药性，克服种种困难。可竞争对手开始报道了大额融资，竞争对手的专利公开，竞争对手拿到了 IND。我的天！！！
领导开始说他们怎么这么快？！合成说和我没关系，兄弟们为了项目进度，天天加班，都睡在公司了。药化说这个结构有问题，提高了溶解度，口服吸收没了。口服吸收好了，活性没了。领导说，那为什么人家跑到前面去了，我不管，我只要结果。
好在有了晶体结构解析，计算部的作用就可以发挥了，基于结合口袋进行片段生长和替换，生成了大量的分子。然后在基于分子的物理性质预测，希望能够在矛盾的性质中发现“太极”结构 [4]。
Novartis 部分：
终于：Two examples of transformations that lower logP while improving permeability are the introduction of the ortho-methyl aniline in compound 3 and the hydroxy pyrimidine in compound 4, HRO761.
最后，计算证明了自己，药化调整可合成性，和合成兄弟搭伙继续加班睡公司。
Vividion 部分：
分析生物数据的时候，发现一点儿异常，左图是 Target engagement，右侧是 DNA unwinding 数据。左图中，项目负责人发现了异常，似乎在活细胞和裂解液中测量靶点的占据率会有两类分子，进一步分析可能是由于裂解液中存在多次稀释，所以 ATP 浓度低了。
右图继续验证，横坐标是没有 ATP，纵坐标为有 ATP 预孵育，立马发现了区别，对角线以上 VVD-109060 系列明显是 ATP 竞争性的，但是下方 VVD-127101 却是协同性的，在ATP 存在下，更好了。最后，Vvidion 采用了 101 系列进一步推进。
